• 主營產品:elisa試劑盒,進口elisa試劑盒,elisa kit,進口血清,進口試劑,明膠酶譜法檢測試劑盒,大鼠elisa檢測試劑盒,人elisa檢測試劑盒

    025-66060117

    訂購熱線

    產品目錄
    標準品
    科研質控品 標準菌株
    二抗
    科研ELISA試劑盒
    人ELISA試劑盒
    小鼠ELISA試劑盒
    大鼠ELISA試劑盒
    豚鼠ELISA試劑盒
    兔子ELISA試劑盒
    豬ELISA試劑盒
    其他ELISA試劑盒
    生化試劑盒
    科研放免試劑盒
    化學溶液
    生物試劑
    農殘檢測試劑
    科研血清
    高品質試劑
    蛋白研究相關試劑
    科研SLB相關試劑
    明膠酶譜法試劑盒
    PCR引物合成服務
    引物合成
    引物設計
    免疫組化實驗代做
    Western blot實驗代做
    實時熒光定量PCR實驗代測
    生化試劑LG
    公司新聞

    Western blot實驗代測有哪些注意事項!

    閱讀次數:162    發布時間:2019/6/25 14:25:28

    Western blot實驗代測有哪些注意事項!


    通過電泳區分不同的蛋白組分,并轉移至固相支持物(膜),通過特異性試劑(抗體)作為探針,對靶物質進行檢測?蓹z測到低至1~5ng(zui低可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。

     


    蛋白樣品制備的注意事項:

    1、細胞數量達5×106

    2、將細胞裂解液再離心,收集上清液,加loading煮樣5min。


    SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項:

    1、做膠:防止漏膠、進氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)

    2、加樣:兩邊加loading,加樣量一樣,加樣時間要盡量短,以免樣品擴散。

    3、電泳:將膠夾好放于電泳槽中,加電泳buffer(內外面不能聯通),將電壓調到90V開始電泳。


    轉膜注意事項:

    1、泡膜:轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移buffer浸泡20min。(1.凝膠若是沒在預冷的轉膜buffer中浸泡,就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮,導致出現轉移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)

    2、轉膜順序:陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

    3、轉膜條件:0.3 250V 1h40min 冰浴中進行轉膜(具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,反之則短)

    4、避免直接用手碰雜交膜,使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。

    5、夾好膜和凝膠后,確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,否則會導致轉膜不完全。

    6、保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣,過大和過小都會影響轉膜效率。

    7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力,從而產生較高的背景,故如果選擇雞來源的抗體zui好使用硝酸纖維素膜(NC膜)

    關于磷酸化蛋白檢測的注意事項:

    1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態!在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑(NaF,可以防止去磷酸化),并將標本時刻保持在冰浴中!

    2、使用5%的BSA作為封閉試劑!不能使用脫脂奶粉。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍,會出現很高的背景)。


    抗體保存注意事項:

    1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存!

    2、對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

      2.1 分裝的量以一次實驗用完為好,zui少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。

      2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來!

      2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

    3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

    4、長期保存,加入疊氮鈉,防止細菌污染。



    Western blot實驗代測有哪些注意事項!


    COPYRIGHT 2003-2004 南京信帆生物技術有限公司 ALL RIGHTS RESEVED  技術支持:阿儀網  管理登錄  ICP備案號:蘇ICP備16008122號-1

    阿儀網推薦收藏該企業網站
    股票配资发朋友圈术语