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    質粒提取試劑盒操作時這一步很重要!

    閱讀次數:151    發布時間:2019/6/20 14:34:15

    質粒提取試劑盒操作時這一步很重要!

     

    產品簡介: 

    試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質粒 DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁,提高酵母質粒 DNA 的產量。吸附柱中采用的硅基質材料能、專一地附 DNA,可*限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學實驗,包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚、lv仿等有毒試劑,操作安全。 

     

    操作步驟: 
    使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇,加入體積請參照瓶上的標簽。溶液YP1在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的 RNaseA全部加入),混勻,置于 2-8℃保存。如非指明,所有離心步驟均為使用臺式
    離心機在室溫下離心。 

    1、取1-5ml酵母培養物(不超過 5×107cells),12000rpm離心 1min,盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。 

    2、酵母細胞壁的破除: 
    A、酶法:向酵母菌體中加入 470ul 山梨醇 Buffer,充分懸浮菌體,加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul β-巰基乙醇,充分混勻,30℃處理 1-2h,期間可顛倒離心管混勻數次。12000rpm 離心 1min,棄上清,收集沉淀。向沉淀中加入 250ul 溶液 YP1(請先檢查是否已加入 RNaseA) ,充分懸浮沉淀。注意:如果菌塊未徹底混勻,會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。 
    B、玻璃珠法:向酵母菌體中加入 250ul 溶液 YP1(請先檢查是否已加入 RNaseA) ,充分懸浮沉淀。加入 150-200ul酸洗玻璃珠(自備),漩渦振蕩 10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底,吸取上清(如上清有所損失,請用溶液 YP1 補足至 250ul)于另一干凈離心管中。 

    3、向離心管中加入 250ul溶液 YP2,溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解。注意:混勻一定要溫和,以
    免污染細菌基因組 DNA,此時菌液應變得清亮粘稠,作用時間不要超過 5 min,以免質粒受到破壞。 

    4、向離心管中加入 350ul溶液 YP3,立即溫和地上下翻轉 6-8次,充分混勻,此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心 10 min,用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中,盡量不要吸出沉淀。注意:溶液 YP3 加入后應立即混合,避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清。 

    5、將上一步所得上清液加入吸附柱中,室溫放置 2min,12000rpm 離心 1min,倒掉收集管中的廢液,吸附柱重新放回收集管中。 

    6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm 離心 1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。 

    7、向吸附柱中加入 500ul漂洗液,12000rpm離心 1min,棄廢液,將吸附柱放入收集管中。 

     

    質粒提取試劑盒操作時這一步很重要!

    8、12000rpm 離心 2min,將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR 等。 

    9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中,向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經 65℃水浴預熱的洗脫液,室溫放置 2min,12000rpm離心 1min。 

    10、為了增加質粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,室溫放置 2min, 12000rpm離心 1min。  

     

    注意事項: 

    1、使用前請先檢查溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現混濁,如有混濁現象,可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,待溶液恢復澄清后再使用。 

    2、洗脫緩沖液體積不應少于 50ul,體積過小影響回收效率;洗脫液的 pH值對洗脫效率也有影響,若需要用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調至此范圍),pH 值低于 7.0 會降低。洗脫效率;DNA產物應保存在-20℃,以防 DNA降解。 

    3、質粒得率與酵母菌株、質?截悢、培養條件等因素有關。通常酵母質?截悢刀己艿,一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到,可通過 PCR或轉化大腸桿菌來檢測。 

    4、DNA濃度及純度檢測:得到的基因組DN**段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關;厥盏玫降腄N**段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰, OD260值為 1 相當于大約 50  μg/ml雙鏈DNA、40  μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會偏低,因為pH值和離子存在會影響光吸收值,但并不表示純度低。 

     

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